摘要 摘要: 以核桃楸青果皮为原料，以固液比、超声温度、超声时间和超声功率为考察因素，通过单因素试验优选核桃楸青果皮中胡桃醌的最佳提取方法，通过 L9 ( 34 ) 正交试验对提取过程进
摘要: 以核桃楸青果皮为原料，以固液比、超声温度、超声时间和超声功率为考察因素，通过单因素试验优选核桃楸青果皮中胡桃醌的最佳提取方法，通过 L9 ( 34 ) 正交试验对提取过程进行优化，结果表明，超声辅助提取为最佳提取方法，其最佳工艺条件: 提取溶剂为 90% 乙醇溶液，固液比 1 mg ∶ 18 L，超声温度 30 ℃，超声时间 30 min，超声功率 200 W，此时胡桃醌的提取率为 1. 72 mg /g。
关键词: 胡桃醌; 核桃楸青果皮; 正交试验; 超声辅助提取
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂核桃楸果实，购自吉林省通化市( 长白山林区) ; 对照品为胡桃醌，纯度≥97% ，由 Sigma 公司生产; 甲醇为色谱纯，由 J&K 化学有限公司生产; 去离子水自制; 其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 仪器 Agilent 1260LC 高效液相色谱仪，配置 G1311 - B 四元泵、G1311 - B 自动进样器、G1316 - A 柱温箱、G1314 - F 紫外检测器，由美国 Agilent 公司生产; Milli - Q 纯水仪，由美国 Millipore 公司生产; KQ - 250DE 型数控超声波清洗器，由江苏省昆山市超声仪器有限公司生产; Allegra X - 30R 型离心机，由美国 Beckman Coulter 公司生产。
1. 3 原料的预处理因胡桃醌为小分子萘醌，于 45 ℃ 左右易升华，所以采用真空冷冻干燥方法，先将核桃楸青果皮用真空冷冻干燥机进行干燥，再将核桃楸青果皮进行粉碎，过 60 ～ 80 目筛，即得试验所需原料[7]。
1. 4 分析方法通过全波长扫描，胡桃醌在 250 nm 处有特征吸收峰，采用高效液相色谱法检测样品中胡桃醌含量( 图 1) [8]。色谱条件为: Agilent ODS - C18色谱柱( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ; 柱温 25 ℃ ; 流速 1. 0 mL/min; 进样量 10 μL; 流动相 A 相为超纯水溶液，B 相为甲醇溶液，流动相配比为 A ∶ B = 35 ∶ 65[9]。
1. 5 胡桃醌标准曲线的建立精确称取胡桃醌标准品 4. 00 mg，用甲醇溶解于 10 mL 容量瓶中，定容[10]，作为标准品贮备液; 精确量取标准品储备液，用甲醇稀释配制成浓度为 0. 2、0. 1、0. 05、0. 025、0. 012 5、 0. 006 25、0. 003 125 mg /mL 的标准品溶液; 分别用 0. 22 μm 滤膜过滤，进行 HPLC 检测，每个浓度重复进样 3 次[11]。以胡桃醌 浓 度 ( XJuglone ) 为横 坐 标，以胡桃醌峰面积积分值 ( YJuglone ) 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线，得 回 归 方 程 YJuglone = 99. 053 XJuglone - 0. 237 15( r 2 = 0. 999 4) ，胡桃醌在 0. 006 25 ～ 0. 3 mg /mL 范围内线性关系良好。
1. 6 提取方法的比较
1. 6. 1 索 式 提 取 法 准确称取绝干核桃楸青果皮样品 1. 0 g，置于 500 mL 索氏提取器烧瓶中，加入 20 mL 乙醇溶液，热回流 2 次，水浴温度为 80 ℃，每次 30 min; 离心，取上清液，用 0. 22 μm 滤膜过滤; HPLC 检测。
1. 6. 2 冷浸法 准确称取绝干核桃楸青果皮样品 1. 0 g，加入 20 mL 乙醇溶液，密封，置于避光处冷浸 12 h; 离心，取上清液，用 0. 22 μm 滤膜过滤; HPLC 检测。
1. 6. 3 超声辅助提取法 准确称取绝干核桃楸青果皮样品 1. 0 g，置于 50 mL 锥形瓶中，加入 20 mL 乙醇溶液，密封，超声辅助提取 30 min( 超声温度 30 ℃、功率 250 W) ; 离心，取上清液，用 0. 22 μm 滤膜过滤; HPLC 检测。
1. 7 单因素试验
1. 7. 1 乙醇浓度对胡桃醌提取率的影响 准确称取绝干核桃楸青果皮样品 1. 0 g，依次加入浓度为 80% 、85% 、90% 、 95% 、100% 的乙醇溶液 20 mL，超声提取 30 min( 超声温度 30 ℃、超声功率 250 W) ; 离心，取上清液，用 0. 22 μm 滤膜过滤; HPLC 检测。
1. 7. 2 固液比对胡桃醌提取率的影响 准确称取绝干核桃楸青果皮样品 1. 0 g，以 1 g ∶ 12 mL、1 g ∶ 14 mL、1 g ∶ 16 mL、 1 g ∶ 18 mL、1 g ∶ 20 mL 的固液比加入 90% 乙醇溶液，超声提取 30 min( 超声温度 30 ℃、超声功率 250 W) ; 离心，取上清液，用 0. 22 μm 滤膜过滤; HPLC 检测。
1. 7. 3 超声温度对胡桃醌提取率的影响 准确称取绝干核桃楸青果皮样品 1. 0 g，以 1 g ∶ 16 mL 的固液比加入 90% 乙醇溶液，在超声功率 250 W 条件下，依次以 20、25、30、35、 40 ℃ 的超声温度反应 30 min; 离心，取上清液，用 0. 22 μm 滤膜过滤; HPLC 检测。
2 结果与分析
2. 1 提取方法的比较游离的醌类化合物一般都具有升华性，而胡桃醌属于小分子萘醌，具有挥发性，温度过高时胡桃醌会随溶剂挥发而损失，导致提取率最低。由图 2 可知，索式提取法对胡桃醌的提取率相对最低; 超声提取法所用时间短、提取效率相对最高，优于冷浸法。
2. 2 单因素对胡桃醌提取率的影响
2. 2. 1 乙醇浓度对胡桃醌提取率的影响 由图 3 可见，随乙醇浓度的增加，胡桃醌提取率逐渐增加，乙醇浓度为 80% ～ 90% 时，胡桃醌提取率增加较快，这是由于有机溶剂的增加有助于胡桃醌的溶解; 当乙醇浓度进一步增加时，胡桃醌提取率增长趋势趋于平缓，基本持平。因此，90% 乙醇溶剂是最为适宜用量。
2. 2. 2 固液比对胡桃醌提取率的影响 由图 4 可见，固液比在 1 g ∶ ( 12 ～ 16) mL 时，胡桃醌提取率随提取溶剂用量的增加而增加，这说明溶剂量增大，会直接影响胡桃醌从原料内部向外部扩散; 固液比在 1 g ∶ ( 16 ～ 20) mL 时，胡桃醌提取率基本持平。考虑到提取溶剂用量增加时，不仅会增加生产成本，还会增加分离纯化难度，所以固液比以 1 g ∶ 16 mL 为宜。
2. 2. 3 超声温度对胡桃醌提取率的影响 由图 5 可见，超声温度为 20 ～ 30 ℃时，胡桃醌提取率随温度上升而增加，这是由于温度升高，胡桃醌扩散系数增大，有效成分浸出速度加快，从而提取率增加较快; 当超声温度为 30 ～ 40 ℃时，胡桃醌提取率下降，这是由于温度过高，胡桃醌结构遭到破坏。所以，超声温度以 30 ℃为宜。
2. 2. 4 超声时间对胡桃醌提取率的影响 由图 6 可见，超声时间为 10 ～ 30 min 时，胡桃醌提取率随提取时间延长而逐渐增加，这是由于随着超声时间的延长，超声波对底物产生的搅拌和空化作用增强，进而使溶出物质增多; 超过 30 min 时，超声波会破坏提取物中部分胡桃醌的结构，从而导致提取率降低。因此，为保证有效成分结构完好且提取尽可能完全，超声时间以 30 min 为宜。
2. 3 正交试验优选最佳工艺组合由表 2、表 3 可见，影响核桃楸青果皮中胡桃醌提取率的因素从大到小依次为固液比 > 超声功率 > 超声时间 > 超声温度，核桃楸青果皮中胡桃醌的最佳提取工艺为 A3B2C2D2，即固液比 1 g ∶ 18 mL、超声温度 30 ℃、超声时间 30 min、超声功率 200 W。按正交试验优化工艺条件进行 3 次验证，测得核桃楸青果皮中胡桃醌的平均提取率为 1. 72 mg / g。
3 结论
胡桃醌为小分子萘醌，45 ℃ 左右易升华，所以索式提取法胡桃醌提取率相对最低。超声提取法由于直接作用于分子内部，提取效率高，提取率高于索氏提取法、冷浸法。本试验对核桃楸青果皮中胡桃醌提取工艺的影响因素进行单因素试验，在此基础上设计正交试验，最终确定超声波辅助提取的最佳工艺条件: 90% 乙醇溶液为溶剂、固液比为 1 g ∶ 18 mL、超声温度为 30 ℃、超声时间为 30 min、超声功率为 200 W，此条件下胡桃醌的提取率为 1. 72 mg / g，这为核桃楸青果皮中有效成分胡桃醌的开发利用提供了一个较为科学合理的理论依据。
参考文献:
[1]曲中原，邹 翔，胡国军，等. 青龙衣中胡桃醌提取工艺研究[J].中医药学报，2008，36( 4) : 30 - 32.
[2]程力惠，黄晓文. 核桃楸树皮中胡桃醌提取方法及其工艺研究[J]. 亚热带植物科学，2010，39( 4) : 33 - 35.
《核桃楸青果皮中胡桃醌的提取工艺》来源：《江苏农业科学》，作者：冯 迟，王舒雅，高 俊，杨紫薇，雍晓雨，周 俊，刘晓宁，郑 涛。
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